Pregabalina miejscowo: nowy mechanizm działania w bólu neuropatycznym

Czy pregabalina działa nie tylko centralnie, ale i obwodowo?

Pregabalina to lek pierwszego rzutu w farmakoterapii bólu neuropatycznego, działający poprzez wiązanie się z podjednostką α2δ-1 (Cacna2d1) kanałów wapniowych w presynaptycznych zakończeniach neuronów. Jednak doustne stosowanie pregabaliny wiąże się z istotnymi działaniami niepożądanymi ze strony ośrodkowego układu nerwowego – zawrotami głowy i sennością. Aplikacja miejscowa pregabaliny mogłaby potencjalnie ograniczyć ekspozycję ogólnoustrojową i zmniejszyć te efekty uboczne. Badania na modelach zwierzęcych wykazały działanie przeciwbólowe przezskórnej aplikacji pregabaliny już 30 minut po podaniu, a u pacjentów z bólem w obrębie twarzy – nawet po 5 minutach od aplikacji wewnątrzustnej preparatu 10% pregabaliny.

Allodynia mechaniczna – ból wywołany bodźcami dotykowymi, które w warunkach fizjologicznych nie powodują bólu – może być ściśle związana ze stymulacją nabłonkowych receptorów dotyku. Komórki Merkela stanowią receptory czuciowe w obszarach wrażliwych na dotyk, takich jak nabłonek bezwłosy, pochewki włosów i błona śluzowa jamy ustnej. Po mechanicznej stymulacji tych receptorów, stężenie wapnia wewnątrzkomórkowego ([Ca²⁺]ᵢ) wzrasta przez różne mechanowrażliwe kanały jonowe, w tym kanały piezo. Następnie [Ca²⁺]ᵢ jest precyzyjnie regulowane przez systemy ekstruzji Ca²⁺, w tym wymiennik Na⁺-Ca²⁺ (NCX) i Ca²⁺-ATPazę błony plazmatycznej (PMCA).

Japońscy naukowcy z Nippon Dental University postawili hipotezę, że pregabalina może działać nie tylko na presynaptyczne zakończenia neuronów, ale również na nabłonkowe receptory dotykowe w tkankach obwodowych. Celem ich badania było wyjaśnienie komórkowego mechanizmu działania przezskórnej aplikacji pregabaliny w łagodzeniu bólu neuropatycznego, ze szczególnym uwzględnieniem kinetyki ekstruzji Ca²⁺ po mechanicznej stymulacji komórek Merkela.

Jak naukowcy odtworzyli warunki bólu neuropatycznego in vitro?

Badacze wykorzystali linię komórkową raka z komórek Merkela (MCC 14/2), ustanowioną ze zmiany skórnej stopy 80-letniego mężczyzny. Komórki te wykazują ogólne właściwości fizjologicznych komórek Merkela. Hodowlę prowadzono w medium RPMI 1640 z 10% surowicą płodową bydlęcą przez 48 godzin w 37°C w atmosferze 5% CO₂.

Aby potwierdzić charakterystykę komórek, przeprowadzono analizę immunofluorescencyjną z użyciem markerów: cytokeratyny (CK) 14 (marker komórek nabłonkowych), CK 8 i 20 (markery komórek Merkela) oraz kanału Piezo2. Wszystkie komórki wykazały immunoreaktywność dla tych markerów, co potwierdziło ich fenotyp komórek Merkela. Dodatkowo zaobserwowano immunoreaktywność dla receptora B1 bradykininy (100% komórek), ale rzadko dla receptora B2 (7,3% komórek).

Stymulację mechaniczną pojedynczych komórek Merkela przeprowadzano za pomocą mikrokapilary ze szkła (średnica końcówki 2-3 μm), którą umieszczano tuż nad błoną komórkową, a następnie przesuwano pionowo w dół o 6,0 μm z prędkością 2,0 μm/s. Stymulację utrzymywano przez 6 sekund. Zmiany [Ca²⁺]ᵢ mierzono za pomocą fluorescencji fura-2, wyrażając je jako stosunek F/F₀ (znormalizowany do wartości bazowej).

Pregabalinę aplikowano na dwa sposoby: krótkoterminowo (5-10 minut przed stymulacją mechaniczną, 100 μM) oraz długoterminowo (24 godziny w medium hodowlanym z 100 μM pregabaliny po 24-godzinnej hodowli bez leku). W grupie z bradykininą, pregabalinę dodawano przez ostatnie 24 godziny 48-godzinnej ekspozycji na BK.

Jakie zmiany wapniowe wywołuje mechaniczna stymulacja komórek Merkela?

Mechaniczna stymulacja komórek Merkela w obecności zewnątrzkomórkowego Ca²⁺ (2,5 mM) powodowała przejściowy wzrost [Ca²⁺]ᵢ do wartości szczytowej 1,72 ± 0,26 F/F₀ (N=11). Po powrocie [Ca²⁺]ᵢ do poziomów spoczynkowych, kolejna stymulacja mechaniczna ponownie wywoływała przejściowy wzrost. Powtarzane stymulacje nie powodowały efektu desensytyzacji – odpowiedzi [Ca²⁺]ᵢ pozostawały stabilne (p > 0,05).

Ani krótkoterminowa (5-10 min), ani długoterminowa (24 h) aplikacja 100 μM pregabaliny nie zmieniała wartości szczytowej wzrostu [Ca²⁺]ᵢ wywołanego stymulacją mechaniczną w warunkach kontrolnych. Wartości szczytowe wynosiły odpowiednio: 1,55 ± 0,17 F/F₀ (N=7, p=0,62) dla aplikacji krótkoterminowej i 1,63 ± 0,21 F/F₀ (N=9, p=0,56) dla długoterminowej, w porównaniu z kontrolą (1,72 ± 0,26 F/F₀).

Naukowcy ocenili również efektywność ekstruzji Ca²⁺ po szczytowym wzroście [Ca²⁺]ᵢ, analizując pole pod krzywą (AUC) przejściowego wzrostu [Ca²⁺]ᵢ w okresie 600 sekund od momentu osiągnięcia wartości szczytowej. W warunkach kontrolnych AUC wynosiło 120,9 ± 60,0 (N=11). Pregabalina nie zmieniała wartości AUC: 101,5 ± 65,9 (N=7, p=0,62) dla aplikacji krótkoterminowej i 86,9 ± 56,2 (N=9, p=0,56) dla długoterminowej.

„Pregabalin did not suppress [Ca²⁺]ᵢ increase and Ca²⁺ extrusion kinetics after direct mechanical stimulation to Merkel cells under physiological conditions” – piszą autorzy badania, wskazując, że w warunkach fizjologicznych pregabalina nie wpływa na procesy mechanoczuciowe.

Co się zmienia w modelu bólu neuropatycznego?

W komórkach poddanych 48-godzinnej ekspozycji na 10 nM agonisty receptora B1 (grupa BK), wartość szczytowa wzrostu [Ca²⁺]ᵢ po stymulacji mechanicznej wynosiła 1,71 ± 0,15 F/F₀ (N=8) – podobnie jak w kontroli (p=0,43). Jednak wartość AUC znacząco wzrosła do 162,4 ± 67,1 w porównaniu z kontrolą (67,2 ± 44,7; p=0,01). To wskazuje na opóźnioną ekstruzję Ca²⁺ i akumulację wapnia wewnątrzkomórkowego – zjawisko obserwowane wcześniej w stanach zapalnych i neuropatii cukrzycowej.

Gdy do komórek z grupy BK dodano pregabalinę przez ostatnie 24 godziny (grupa BK + pregabalina), wartość AUC znacząco spadła do 87,1 ± 46,9 (N=8, p=0,03 vs grupa BK) – powracając do poziomu zbliżonego do kontroli. Wartość szczytowa [Ca²⁺]ᵢ pozostała niezmieniona (1,61 ± 0,14 F/F₀, p=0,78 vs BK).

Te wyniki sugerują, że pregabalina działa poprzez modulację aktywności NCX1, normalizując upośledzoną ekstruzję Ca²⁺ wywołaną długotrwałą ekspozycją na agonistę receptora B1. Immunofluorescencja potwierdziła, że komórki Merkela wykazują silną immunoreaktywność dla NCX1 (91,7 ± 11,5%), ale słabą dla NCX2 (7,8 ± 5,0%) i NCX3 (6,7 ± 2,7%).

Czy pregabalina wpływa na kanały wapniowe zależne od napięcia?

Badacze sprawdzili również, czy pregabalina wpływa na kanały wapniowe zależne od napięcia, stosując stymulację depolaryzującą za pomocą roztworu o wysokim stężeniu K⁺ (50 mM). Chociaż komórki Merkela wykazywały immunoreaktywność dla Cacna2d1 (podjednostki α2δ-1 kanałów wapniowych – znanego miejsca wiązania pregabaliny), ekspresja była głównie w jąderku komórkowym, rzadko w błonie komórkowej lub cytoplazmie.

Stymulacja depolaryzująca wywoływała przejściowy wzrost [Ca²⁺]ᵢ do wartości szczytowej 1,12 ± 0,02 F/F₀ w grupie kontrolnej (N=5). Długoterminowa aplikacja 100 μM pregabaliny (24 h) nie zmniejszała wartości szczytowej wzrostu [Ca²⁺]ᵢ (1,11 ± 0,01 F/F₀, N=6, p=0,57). Podobnie, w komórkach poddanych 48-godzinnej ekspozycji na BK, pregabalina nie wpływała na odpowiedź depolaryzacyjną: 1,10 ± 0,01 F/F₀ w grupie BK (N=5) vs 1,12 ± 0,01 F/F₀ w grupie BK + pregabalina (N=7, p=0,49).

„Pregabalin did not suppress [Ca²⁺]ᵢ increase upon depolarizing stimulation using a high-K⁺ solution” – podkreślają autorzy, wskazując, że pregabalina nie działa na kanały wapniowe w komórkach Merkela, ale raczej na NCX1.

Jaki jest mechanizm działania pregabaliny na poziomie komórkowym?

Wyniki badania wskazują na nowy, dotychczas nieopisany mechanizm działania pregabaliny w tkankach obwodowych. W warunkach fizjologicznych pregabalina nie wpływa na mechanotransdukcję ani ekstruzję Ca²⁺ w komórkach Merkela. Jednak w warunkach symulujących ból neuropatyczny (długotrwała ekspozycja na agonistę receptora B1), pregabalina przywraca prawidłową homeostazę wapniową poprzez zwiększenie aktywności ekstruzji Ca²⁺ przez NCX1.

Akumulacja [Ca²⁺]ᵢ w komórkach Merkela, wywołana upośledzoną aktywnością NCX, może obniżać próg mechanowrażliwości i prowadzić do nieprawidłowego lub wzmożonego uwalniania neuroprzekaźników z tych komórek. Glutaminian, główny neuroprzekaźnik uwalniany z komórek Merkela, aktywuje receptory NMDA na włóknach Aβ, pośrednicząc w przekazywaniu sygnałów czuciowych. Nabyte właściwości niskiego progu w komórkach Merkela mogą być zaangażowane w allodynię – stan, w którym ból występuje nawet przy bardzo słabych bodźcach dotykowych.

NCX to niskopowinowactowy, wysokopojemnościowy system ekstruzji Ca²⁺, odpowiedzialny za usuwanie wapnia po dużych wzrostach [Ca²⁺]ᵢ. Wiadomo, że aktywność NCX w neuronach nocyceptywnych zmniejsza się podczas odpowiedzi zapalnej, a czasowy przebieg spadku aktywności NCX koreluje ze zmniejszeniem progu nocyceptywnego wywołanego zapaleniem. Pregabalina prawdopodobnie normalizuje lub przyspiesza upośledzoną aktywność NCX spowodowaną dysfunkcją komórkową indukowaną przez bradykininę.

Autorzy nie wykluczają, że pregabalina może również hamować odwrotny tryb NCX (napływ Ca²⁺), który jest aktywowany przez receptory B1. Jednak w takim przypadku wartość AUC nie zwiększyłaby się po podaniu inhibitorów NCX, co obserwowano w badaniu.

Co to oznacza dla praktyki klinicznej?

Odkrycie obwodowego mechanizmu działania pregabaliny – niezależnego od jej wpływu na centralne zakończenia presynaptyczne – dostarcza naukowego uzasadnienia dla miejscowej aplikacji pregabaliny w leczeniu bólu neuropatycznego. Badania kliniczne już wykazały, że aplikacja wewnątrzustna preparatu 10% pregabaliny u pacjentów z bólem w obrębie twarzy po ekstrakcji zęba wywołuje efekt przeciwbólowy po zaledwie 5 minutach. Przezskórna aplikacja pregabaliny w modelach zwierzęcych (szczurów z częściowym podwiązaniem nerwu kulszowego, myszy z podwiązaniem nerwu rdzeniowego) wykazała działanie przeciwbólowe już 30 minut do 1 godziny po aplikacji.

Miejscowa aplikacja pregabaliny może oferować kilka przewag klinicznych:

• Redukcja ogólnoustrojowej ekspozycji – mniejsze ryzyko zawrotów głowy, senności i innych działań niepożądanych ze strony OUN
• Szybszy początek działania – bezpośrednie dotarcie do receptorów obwodowych w tkance nabłonkowej
• Celowane działanie – szczególnie korzystne w bólu zlokalizowanym (np. neuropatia popółpaścowa, ból w obrębie twarzy, allodynia mechaniczna)
• Możliwość stosowania u pacjentów z przeciwwskazaniami do leczenia ogólnoustrojowego lub u osób nietolerujących działań niepożądanych

Autorzy podkreślają jednak, że badanie ma istotne ograniczenia. Model in vitro nie uwzględnia międzykomórkowej komunikacji synaptycznej między komórkami Merkela a neuronami dośrodkowymi. Nie badano również wpływu pregabaliny na neurony, co jest kluczowe dla pełnego zrozumienia mechanizmu działania przeciwbólowego. Przyszłe badania powinny wykorzystać system współhodowli komórek Merkela z neuronami, aby zbadać synaptyczne przekazywanie sygnałów.

Ponadto, w badaniu zastosowano 100 μM pregabaliny – stężenie, które w poprzednich badaniach wykazało maksymalny efekt w hamowaniu skurczu mięśni szkieletowych indukowanego stymulacją nerwową. Jednak ostateczne stężenie pregabaliny w warstwie podstawnej komórek po miejscowej aplikacji na tkankę nabłonkową pozostaje nieznane i wymaga dalszych badań farmakokinetycznych.

Czy miejscowa pregabalina to przyszłość terapii bólu neuropatycznego?

Badanie japońskich naukowców po raz pierwszy wykazało, że pregabalina może działać na obwodowe receptory czuciowe – komórki Merkela – poprzez modulację aktywności wymiennika Na⁺-Ca²⁺ typu 1 (NCX1), niezależnie od jej klasycznego wpływu na kanały wapniowe w ośrodkowym układzie nerwowym. W warunkach symulujących ból neuropatyczny, pregabalina przywraca prawidłową homeostazę wapniową, zapobiegając akumulacji Ca²⁺ wewnątrzkomórkowego i potencjalnie utrzymując fizjologiczny próg mechanowrażliwości. Odkrycie to dostarcza mechanistycznego wyjaśnienia dla klinicznych obserwacji skuteczności miejscowej aplikacji pregabaliny w łagodzeniu bólu neuropatycznego i allodynii mechanicznej. Miejscowa aplikacja pregabaliny na tkankę nabłonkową może redukować uporczywy ból przy jednoczesnym ograniczeniu działań niepożądanych związanych z leczeniem ogólnoustrojowym. Wymaga to jednak potwierdzenia w badaniach klinicznych z odpowiednio dobranymi formulacjami farmaceutycznymi i ocenami farmakokinetycznymi.